自然科學領域教學資源

miRNAs介導的表觀遺傳修飾(miRNAs mediated epigenetic modification)

公告時間:2019-04-18


科技新知:miRNAs介導的表觀遺傳修飾(miRNAs mediated epigenetic modification)

緣起

在我修讀博士班時必須進行實驗室的「Rotation」, 因此待過幹細胞實驗室、生物資訊實驗室和分生實驗室。當時「幹細胞基因」鑑定為熱門主題,有數個傑出實驗室發表幾種不同幹細胞製備方式的微陣列資料集(microarray datasets)。由資料集找出在包括胚胎幹細胞、血液幹細胞和神經幹細胞等不同種類幹細胞中所表達的基因交集,由此鑑定為代表「幹細胞基因」(stemness genes)。各實驗室的實驗結果各得到大約200個「幹細胞基因」。

當時受到這批研究狂潮的感染,我也著手進行一個小計畫,收集3個不同實驗室所發表的資料集做分析,找出不同實驗室間重疊的「幹細胞基因」。排除各實驗室不同操作方式的實驗誤差,我預期這些最終交集的基因便可能是維持幹細胞活性的關鍵調節因子。不幸的是,我並沒有找到重疊的「幹細胞基因」。我的分析結果,於不同實驗室製備的所有幹細胞中,發現只有一個共同基因的表現量增加 - 即Hes1。

Hes1是Notch下游的分子,功能為轉錄抑制因子。有幾篇文獻報導指出Hes1參與維持幹細胞幹性(Stemness)。但是,幹細胞的幹性不可能完全由這個單一基因決定。

由於無法找到幹性的決定基因,我翻閱許多期刊論文,尋找對這個研究結果的解釋。在我閱覽的文章中,有一個讓我覺得特別有趣的理論,即「明暗對比幹細胞假說」(the chiaroscuro stem cell hypothesis)。

此假說以造血幹細胞為例,指出幹細胞系統並不是逐一分階層的。事實上,幹細胞的功能非常具有可塑性。目前現有資料顯示,幹細胞植入(engraftment)和前驅細胞(progenitor)的表型會隨細胞週期的轉換而變化,其基因表現也有很大差異。

這些觀察結果顯示,並沒有前驅細胞或幹細胞的層級之分,這兩種細胞其實是可逆的一體兩面。而這種變化,可能取決於細胞週期轉換時染色質結構和基因表現的變化。

 

adapted from Blood, Vol. 100, Issue 13, 4266-4271

 

如上圖所示,當早期骨髓幹細胞經歷細胞週期轉變時,染色質表面會改變,因此活化不同的轉錄區域,從而導致不同的基因表現。 此種變化是幹細胞可逆轉變表型的基礎原理。如果這個假設適用於所有幹細胞的話,則研究表觀遺傳修飾(epigenetic modification)的調節將會是揭示「幹性」機制的關鍵步驟。

越來越多的證據表明染色質修飾與幹細胞特徵密切相關。但誘導這種表觀遺傳修飾的訊號分子是什麼呢?在搜尋許多期刊之後,我發現 RNA分子可能是潛在的候選者。

蛋白質的表現必須再經過轉譯步驟,而RNA分子能僅由轉錄單一步驟產生。因此可節省能量,使RNA在細胞中大量存在或長期保存更為合理可行。由於互補的鹼基配對,RNA能夠專一性地識別RNA和DNA分子,並引導其結合蛋白以在特定基因座(gene locus)發揮其生物學功能。

RNA分子是穩定的。由於它們的分子很小,小分子RNA可以比蛋白質更快地擴散,並且可以大幅擴增濃度以引起巨大的生物學效應。由於以上這些原因,RNA可能是比蛋白質更強大的調節分子。特別是對於細胞分化或細胞命運決定(cell fate determination)的調節,當必須改變全體基因表達模式時,小分子RNA可能是誘導細胞發生這些變化的訊號。

小分子RNA即MicroRNA(miRNA) 為小片段RNA,可調節多種生物基因表現。其調節機制包括RNA不穩定性、蛋白質合成,以及近年來發現的染色質修飾反應。這三種機制均可在酵母、植物和果蠅細胞中作用。而在哺乳動物細胞中,目前僅有發現同源RNAi的RNA切割和轉譯抑制活性。

RISC(RNA-induced silencing complex) 是RNAi和miRNA調節途徑的關鍵成分。此複合物包括siRNA / miRNA,Dicer和Argonaute。 miRNA賦予目標辨識專一性,Dicer隸屬於核糖核酸酶III家族的酵素。 Argonaute基因家族包含具有未知生化功能的蛋白質。 Argonaute蛋白質為100-kD鹼性蛋白質,包含兩個共同結構域(protein domain),PAZ和PIWI結構域。 Argonaute蛋白質依據其結構與 Arabidopsis Argonaute1或 Drosophila Piwi 的相似程度而分為兩類。哺乳動物有四種Argonaute蛋白質,Ago1至Ago4。研究報導顯示,Ago2是哺乳動物RNAi的催化成份。其他三種Argonaute蛋白質的生物學功能則尚不清楚。

Argonaute蛋白是小分子RNA介導的基因靜默(small RNA mediated gene silencing)的主要作用分子。小鼠基因組中有8種Argonaute蛋白,Ago2是被研究得最徹底的蛋白質。我的邏輯是,改變細胞命運的胞內調節作用應該位在調節階層的頂端,因此研究重點不會放在轉錄後調節作用(posttranscriptional regulation)。而儘管miRNAs介導的表觀遺傳修飾(miRNAs mediated epigenetic modification)在哺乳動物細胞中的研究文獻較少,卻是相當值得探究的主題。

 

 

基因編譯的新時代

雖然初衷是找出幹細胞基因,但是研究過程中出現了一個很亮眼的機制--小分子RNA(small RNAs)在細胞中的調節功能。即便其對細胞命運決定的調節之謎尚未解開,目前對此種分子作用的了解以足以應用於生物技術開發。先著眼於小分子RNA和其結合蛋白的作用。小片段RNA分子能作為其結合蛋白的嚮導分子,引導結合蛋白切斷特定基因座的基因,達到基因標靶(gene targeting)功能。利用此種基因導航功能,改革了傳統的基因編譯技術。

傳統「基因剔除」(gene  knockout)技術運用基因同源性重組(homologous recombination)的原理,科學家們用一段與目標基因「相似但不完全相同」的DNA 補丁(patch)與目標基因互換,藉此來改變目標基因的表現。同源性重組原本就是一種具有專一性置換的方法,缺點是成功機率很低,約只有百萬分之一,所以科學家們巧妙的整合胚胎幹細胞的培養、基因轉殖以及細胞篩選的手段來提升成功機率。如果能夠運用小片段RNA分子的基因嚮導功能,想必能大幅提升基因剔除或是置換的成功機率。

敏銳的科學家們很快地找出適用於多樣物種細胞的工具,Cas9蛋白。CRISPR技術已付諸實際應用,相關生技公司紛紛成立,同時被運用於基礎研究和醫學、農工等產業,開啟基因改造的大門。伴隨其蓬勃的前景,相關的道德隱憂也隨之而生。